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Secuenciamiento en chips—hacia los $1000 por genoma

El secuenciamiento de ADN ha sido uno de los pilares básicos en el desarrollo de la biología molecular, la ingeniería genética y la biotecnología; así como también, ha permitido conseguir grandes avances en el campo de la medicina, ayudando en el diagnóstico de enfermedades y en la identificación de genes asociados con la predisposición a determinadas patologías. Sin embargo, aún sigue siendo un procedimiento relativamente costoso a pesar que el precio de secuenciamiento por Megabase (Mb) ha caído vertiginosamente en los últimos 10 años gracias al desarrollo novedosos equipos. Uno de ellos es el Ion Personal Genome Machine™ el cual se basa en el uso de semiconductores, abriendo el camino hacia una nueva generación de secuenciadores.

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Todo empezó hace unos 36 años, cuando el ingenioso bioquímico inglés Frederick Sanger desarrolló la primera técnica de secuenciamiento de ADN. El procedimiento —al cual posteriormente llamaron Método de Sanger— era sumamente complejo, ya que requería del uso de nucleótidos marcados con fósforo radiactivo (P-32), nucleótidos desoxigenados (ddNTPs), cuatro reacciones en paralelo y un gel de electroforesis muy largo. Sin embargo, esta fue la base para el desarrollo de los secuenciadores automatizados de primera generación, los cuales cambiaron la radiactividad por la fluorescencia y el gel de electroforesis por capilares cromatográfico. Con los secuenciadores basados en el método de Sanger se secuenció el genoma humano allá por el año 2003, el cual costó unos $3,000 millones.

Luego vinieron los primeros secuenciadores por síntesis, los cuales se basan en la lectura de la secuencia de ADN a partir de la síntesis de la hebra complementaria gracias a la acción de una ADN polimerasa. Entre ellas tenemos los pirosecuenciadores, los cuales se basan en la detección de luminiscencia emitida durante la reacción de síntesis del ADN y la tecnología SOLiD™, que se basa también en la detección de fluorescencia emitida durante una reacción de ligación de ADN. Gracias a ellos se han podido desarrollar proyectos de secuenciamiento a gran escala ya que estos equipos permiten secuenciar millones de fragmentos a la vez.

Sin embargo, el principal problema con estas novedosas tecnologías son sus altos costos —cada equipo llega a valer unos $500,000 y cada corrida entre $10,000 y $20,000— y el tiempo que tardan —unos 20Mb por hora, sin incluir el tiempo de preparación de las muestras. Por otro lado, están limitados por la tecnología de imágenes, a los intermediarios electromagnéticos y luminosos y a los reactivos especiales y costosos.

Fue hace un poco más de siete meses cuando Ion Torrent, parte de la corporación Life Technologies™ lanzó al mercado su nuevo secuenciador a base de chips de iones. Este nuevo secuenciador cambió toda la tecnología pasando a una nueva generación de equipos a base del uso de los ISFET (transistor de campo eléctrico sensible a iones) dentro de un circuito integrado del tipo CMOS (Semiconductor Complementario Metal-Óxido).

Bueno, creo que me excedí de tecnicismos, así que lo explicaré de manera sencilla. El dispositivo consiste en un pequeño chip (tal como se ve en la figura inicial) el cual tiene 1.2 millones de pocillos de 3.5um de diámetro. En cada pocillo —que es donde se llevará a cabo la reacción de síntesis de ADN— están los semiconductores y los  ISFET, que no son más que unos sensores de pH sumamente pequeños.

sensor

Entonces lo que ocurre es lo siguiente: se carga la muestra de ADN anclado a unas pequeñas esferas de acrilamida (bolita rosada) en el chip, las hebras de ADN entrarán en cada uno de los 1.2 millones de pocillos donde se encuentra la enzima ADN polimerasa. Luego, se añaden los nucleótidos naturales —no tienen que ser ni marcados con fluorescencia ni radiactividad— uno por uno (A, T, C, G, A, T…) lavando el dispositivo entre cada uno de ellos a fin de eliminar los nucleótidos remanentes que queden. Cada vez que uno de los nucleótidos encuentre su complementario en la hebra molde (A con T y C con G) se formará el enlace y empezará a sintetizarse la nueva cadena. Cada vez que se forma un enlace, la reacción libera un ión de Hidrógeno (H+), el cual cambiará ligeramente el pH de la solución en proporción al número de nucleótidos incorporados. Este cambio de pH tan insignificante es detectado por los sensores del semiconductor que se encuentra en la base del pocillo y se producirá una señal eléctrica en función a la diferencia de potencial generado (ΔV). Los componentes electrónicos transformarán esta señal eléctrica en una digital y así se procede a leer las millones de secuencias generadas. Todo el proceso toma unos 4 segundos y la precisión de secuenciamiento es superior al de los métodos tradicionales basados en luminiscencia.

Este novedoso equipo fue probado secuenciando los genomas completos de cinco bacterias con secuencias anotadas en el GenBank (3 E. coli, V. fischeri y R. palustris). Para secuenciar estos genomas tan sólo se usó un chip por cada uno de ellos, en otras palabras, se necesito de una sola corrida la cual tomó tan sólo 2 horas, demostrando así la facilidad y rapidez del Ion PGM™. Además, el costo del chip en el mercado es de $99 y el del equipo unos $50,000 —unas 10 veces menos que los equipos tradicionales.

Su utilidad se demostró rápidamente al ser usado para secuenciar el genoma de la E. coli O104:H4, la cual causó un brote infeccioso en Alemania, reportándose unos 1,000 casos y causando la muerte de unas 50 personas.

Pero el mayor logro del equipo fue secuenciar el genoma de nada menos que Gordon Moore, quien fuera el cofundador de Intel™ y que en 1965 estableció su famosa Ley de Moore en la cual establece que el número de transistores que entrarán en un chip se duplicarán cada dos años. Es esta ley la que ha permitido el desarrollo tan vertiginoso y la caída de los precios de los equipos electrónicos tales como las computadoras, celulares, cámaras digitales, etc.

Para secuenciar el genoma de Moore se necesitaron 1,601 chips de 1.2 millones de pocillos, 267 de 6.1 millones y 28 de 11.1 millones, siendo estos dos últimos actualmente están en desarrollo para salir al mercado. Se usó como patrón de comparación el secuenciador SOLiD™, demostrándose que el Ion PGM™ tiene un rendimiento comparable y hasta superior al que era el equipo más moderno hasta la fecha.

Durante los siete primeros meses que estuvo el equipo en el mercado se vendía el chip Ion 314™ el cual permite leer 10Mb de información. La semana pasada salió al mercado el chip Ion 316™ que permite leer 100Mb de información y se espera que para dentro de 3 meses salga el Ion 318™ el cual permitirá leer 1Gb de información. Y según la Ley de Moore, con el paso de los años se podrá duplicar la cantidad de información leída por cada chip y con ella los costos se reducirán cada vez más, seguro hasta llegar al ansiado $1,000 por genoma, el cual permitirá usar el secuenciamiento como técnica rutinaria en el diagnóstico de enfermedades.

Sin dudas, este nuevo equipo de secuenciamiento se impondrá en muchos laboratorios del mundo gracias a su eficiencia, rendimiento, su bajo costo ($49,500 el equipo y $99 el chip) y facilidad de uso, tal como lo demuestra el presente video:


Referencia:

ResearchBlogging.orgRothberg, J., Hinz, W., Rearick, T., Schultz, J., Mileski, W., Davey, M., Leamon, J., Johnson, K., Milgrew, M., Edwards, M., Hoon, J., Simons, J., Marran, D., Myers, J., Davidson, J., Branting, A., Nobile, J., Puc, B., Light, D., Clark, T., Huber, M., Branciforte, J., Stoner, I., Cawley, S., Lyons, M., Fu, Y., Homer, N., Sedova, M., Miao, X., Reed, B., Sabina, J., Feierstein, E., Schorn, M., Alanjary, M., Dimalanta, E., Dressman, D., Kasinskas, R., Sokolsky, T., Fidanza, J., Namsaraev, E., McKernan, K., Williams, A., Roth, G., & Bustillo, J. (2011). An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing Nature, 475 (7356), 348-352 DOI: 10.1038/nature10242

Esta entrada participa en el Carnaval de Biología de Verano celebrado en MariMarus Blog.

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