Los animales KO (knock-out) son aquellos a los cuales, mediante técnicas de ingeniería genética, se les ha bloqueado la función de uno o más genes, ya sea silenciándolos o extrayéndolos. Sin embargo, la tecnología KO no ha podido ser aplicada ampliamente en mamíferos y sólo está restringido a los ratones de laboratorio. Un grupo de científicos alemanes, liderados por la Dra. Janet Hauschild del Instituto Friedrich-Loeffler han logrado obtener cerdos KO usando nucleasas unidas a dedos de zinc según reportaron ayer en PNAS.
Los animales KO son una tecnología valiosa porque permiten entender la función que cumplen determinados genes, especialmente, aquellos involucrados con el desarrollo de ciertas enfermedades. Para obtener animales KO se requieren de dos pasos importantes: el desarrollo de la línea celular KO y la clonación del animal. Para obtener células KO, los científicos usan el mecanismo de recombinación genética, donde un gen es inactivado cuando otro gen es insertado dentro de su secuencia. El problema de esta técnica radica en que es bastante ineficiente, demanda mucho tiempo y requiere de un tratamiento selectivo con antibióticos que a la larga podría dañar a las mismas células KO. Por otro lado, la proporción de células KO obtenidos por esta vía es muy baja (10-5 – 10-6).
El descubrimiento de los dedos de zinc —pequeños dominios estabilizados por el Zn que reconocen secuencias específicas de ADN— ha sido muy importante para la ingeniería genética. Gracias a ellos, los científicos ahora tienen la capacidad de insertar genes en regiones específicas del genoma. Para ello hay que acoplar una nucleasa a los dedos de zinc para que tenga la capacidad de cortar el ADN y dar un lugar donde insertar el gen de interés. Por otro lado, los dedos de zinc unidos a nucleasas (ZFN) también puede ser usados para remover genes y desarrollar células KO.
Usando los ZFN se han logrado obtener moscas de la fruta, peces zebra y ratas KO, pero no animales más grandes, complejos como los cerdos. Los cerdos son la especie preferida para crear modelos biológicos más parecidos a los humanos, ya que con ellos compartimos características fisiológicas y anatómicas, además que tenemos casi la misma esperanza de vida. Por ejemplo, en el 2009, Roggers et al. desarrollaron un cerdo KO para el gen cftr el cual está involucrado en el desarrollo de la fibrosis quística. Los cerdos CFTR-KO mostraron la misma sintomatología clínica y patológica que los humanos; mientras que los ratones CFTR-KO —principales modelos biológicos usados en la actualidad— no.
Por otro lado, tenemos la posibilidad de usar órganos de cerdo para trasplantes humanos. Sin embargo, el principal problema es la presencia de un antígeno en los cerdos conocido como epítopo Gal, el cual es producido por la enzima α1,3-galactosiltransferasa. Este epítopo genera una respuesta inmune en el hombre provocando la destrucción del órgano trasplantado. La solución sería inactivar el gen que codifica esta enzima, la ggta1, para evitar el rechazo del órgano.
Hauschild et al. solucionaron el problema usando por primera vez la tecnología ZFN en cerdos. Primero, los investigadores diseñaron dedos de zinc específicos que reconocieran el gen ggta1. Luego, lo unieron a una nucleasa para generar el ZFN y, mediante un plásmido, lo introdujeron en células de fibroblasto porcino. Se obtuvo un 1% de células GGTA1-KO —10,000 veces más que usando el mecanismo de recombinación genética.
Las células gal— fueron separadas de las células normales usando perlas magnéticas. Luego les extrajeron los núcleos a estas células del fibroblasto ‘knockeados’ y los introdujeron en células embrionarias para generar un clon de cerdo mediante una técnica conocida como Transferencia de Núcleo de Célula Somática (la misma técnica empleada para generar a la oveja Dolly). Los investigadores obtuvieron un total de 6 fetos sanos de cerdos GGTA1-KO, aunque nacieron con un peso relativamente bajo a los cerdos normales. Sin embargo, los cerdos transgénicos fueron fenotípicamente similares a los cerdos normales, la diferencia es que presentaban el gen gtta1 inactivado en ambos alelos (homocigota). Como el ZFN fue introducido vía un plásmido, no se observó una integración en el genoma de los cerdos.
Finalmente, los investigadores probaron si estas células carentes del epítopo gal no generarían rechazo si se usan en transplantes. Para ello, Hauschild et al. sometieron a los fibroblastos GGTA1-KO a un tratamiento con anticuerpos humanos. Los fibroblastos normales no transformados fueron destruidos rápidamente, mientras que los fibroblastos knockeados no excedió del 10%.
Sin dudas este estudio abre las puertas hacia el desarrollo de cerdos KO, los cuales serían mejores modelos biológicos para los humanos, que podría beneficiarnos tanto en el entendimiento de nuestras principales patologías como en el desarrollo de órganos para trasplante. Por otro lado, también se vería beneficiada la industria porcina, mejorando la calidad de las carnes, productividad y resistencia a enfermedades.
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