Los biotecnólogos han sufrido mucho para desarrollar las variedades de plantas mejoradas que hoy conocemos, esto debido a que las técnicas actuales de transformación genética no son específicas (los genes insertados en las plantas se alojan en lugares aleatorios del genoma) y son relativamente ineficientes (con muchos problemas para regener los explantes y obtener las características deseadas).
Una novedosa técnica ha sido desarrollada para insertar, de manera específica, los genes deseados en las plantas, solucionando los inconvenientes generados por por la arbitrariedad de los métodos tradicionales. Las nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) son módulos de reconocimiento de ADN basados en los motivos proteicos dedos de zinc fusionados a una endonucleasa, con la capacidad de cortar el ADN de doble hebra en sitios específicos y producir una recombinación genética (tal como se da en una meiosis). Además, las ZFN pueden ser modificadas para reconocer cualquier tipo de secuencia de ADN, de esta manera las podemos diseñar para cortar sitios específicos del genoma de una planta.
Para el presente estudio se uso como blanco al gen IPK1 del maíz, que codifica para la inositol-1,3,4,5,6-pentakisfosfato 2-kinasa, enzima que cataliza el paso final de la biosítesis del fitato en las semillas del maíz. Este gen fue seleccionado porque la reducción de la cantidad de fitato tendrá un gran impacto en la agricultura. Este compuesto representa el 75% del fósforo presente en las semillas, así que considerado como un componente antinutricional en los cereales forrajeros y contribuye con la contaminación del ambiente a través del flujo de sus residuos.
Primero se demostró que los cortes en el ADN producidos por la ZFN pueden ser reparados por la maquinaria celular pero generando deleciones e inserciones en el sitio de corte. Se probó la transformación genética con ZNF usando un gen de resistencia a herbicida (PAT). Se crearon dos vectores, uno que expresa la resistencia a herbicida de manera autónoma (cuenta con su propio promotor) y otra no autónoma (usa el promotor del IPK1). Como era de esperarse, la versión autónoma del PAT fue mucho más eficiente que la no autónoma, aunque está última fue más eficiente que usando la transformación genética tradicional.
Luego se probó si la ZNF era específica y no producía modificaciones no deseadas en el genoma de la planta, para esto se usó al gen IPK2, que un 98% de su secuencia es idéntica a IPK1. No se encontró cambios en el IPK2 lo que sugiere que la ZNF tiene una acción específica.
Finalmente se analizó si el gen de resistencia a herbicidas insertado en el maíz persistía en las siguientes generaciones. Se hicieron dos pruebas: en una se autopolinizaron las plantas resistentes y en la otra se cruzó con una variedad de maíz cultivada (DAS5XH751) sin la resistencia al herbicida. Al ver el genotipo de las plantas generadas por autopolinización se observó una segregación 2:6:1 (silvestre:heterocigota:homocigota) y en las plantas generadas por el cruce se observó una segregación 1:1 (silvestre:heterocigota). Esto quiere decir que la resistencia puede ser pasada a la siguiente generación mediante una reproducción sexual normal.
Ahora aquí puede venir el riesgo. Un gen insertado mediante el mecanismo de la ZNF puede llegar a contaminar plantas que no tengan el transgen, porque al encontrar su homólogo en una planta silvestre puede haber recombinación genética y ser segregado a las siguientes generaciones en una proporción 1:1, las medidas de bioseguridad deben ser mucho más cuidadosas para el uso de esta nueva tecnología.
Referencia:
Una novedosa técnica ha sido desarrollada para insertar, de manera específica, los genes deseados en las plantas, solucionando los inconvenientes generados por por la arbitrariedad de los métodos tradicionales. Las nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) son módulos de reconocimiento de ADN basados en los motivos proteicos dedos de zinc fusionados a una endonucleasa, con la capacidad de cortar el ADN de doble hebra en sitios específicos y producir una recombinación genética (tal como se da en una meiosis). Además, las ZFN pueden ser modificadas para reconocer cualquier tipo de secuencia de ADN, de esta manera las podemos diseñar para cortar sitios específicos del genoma de una planta.
Para el presente estudio se uso como blanco al gen IPK1 del maíz, que codifica para la inositol-1,3,4,5,6-pentakisfosfato 2-kinasa, enzima que cataliza el paso final de la biosítesis del fitato en las semillas del maíz. Este gen fue seleccionado porque la reducción de la cantidad de fitato tendrá un gran impacto en la agricultura. Este compuesto representa el 75% del fósforo presente en las semillas, así que considerado como un componente antinutricional en los cereales forrajeros y contribuye con la contaminación del ambiente a través del flujo de sus residuos.Primero se demostró que los cortes en el ADN producidos por la ZFN pueden ser reparados por la maquinaria celular pero generando deleciones e inserciones en el sitio de corte. Se probó la transformación genética con ZNF usando un gen de resistencia a herbicida (PAT). Se crearon dos vectores, uno que expresa la resistencia a herbicida de manera autónoma (cuenta con su propio promotor) y otra no autónoma (usa el promotor del IPK1). Como era de esperarse, la versión autónoma del PAT fue mucho más eficiente que la no autónoma, aunque está última fue más eficiente que usando la transformación genética tradicional.
Luego se probó si la ZNF era específica y no producía modificaciones no deseadas en el genoma de la planta, para esto se usó al gen IPK2, que un 98% de su secuencia es idéntica a IPK1. No se encontró cambios en el IPK2 lo que sugiere que la ZNF tiene una acción específica.
Finalmente se analizó si el gen de resistencia a herbicidas insertado en el maíz persistía en las siguientes generaciones. Se hicieron dos pruebas: en una se autopolinizaron las plantas resistentes y en la otra se cruzó con una variedad de maíz cultivada (DAS5XH751) sin la resistencia al herbicida. Al ver el genotipo de las plantas generadas por autopolinización se observó una segregación 2:6:1 (silvestre:heterocigota:homocigota) y en las plantas generadas por el cruce se observó una segregación 1:1 (silvestre:heterocigota). Esto quiere decir que la resistencia puede ser pasada a la siguiente generación mediante una reproducción sexual normal.
Ahora aquí puede venir el riesgo. Un gen insertado mediante el mecanismo de la ZNF puede llegar a contaminar plantas que no tengan el transgen, porque al encontrar su homólogo en una planta silvestre puede haber recombinación genética y ser segregado a las siguientes generaciones en una proporción 1:1, las medidas de bioseguridad deben ser mucho más cuidadosas para el uso de esta nueva tecnología.Referencia:
Shukla, V., Doyon, Y., Miller, J., DeKelver, R., Moehle, E., Worden, S., Mitchell, J., Arnold, N., Gopalan, S., Meng, X., Choi, V., Rock, J., Wu, Y., Katibah, G., Zhifang, G., McCaskill, D., Simpson, M., Blakeslee, B., Greenwalt, S., Butler, H., Hinkley, S., Zhang, L., Rebar, E., Gregory, P., & Urnov, F. (2009). Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases Nature, 459 (7245), 437-441 DOI: 10.1038/nature07992
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